ELISA rinkinių testavimo reikalavimai

Atlikdami oficialų testą atlikite gerą kontrastą, turi būti paimtos teigiamos ir neigiamos kontrolės tyrimo sąlygos, o tiriami mėginiai turi būti pagaminti dviem egzemplioriais, kad būtų užtikrintas tyrimo rezultatų tikslumas.

Kartais fonas yra didesnis, rodantis nespecifinę reakciją, gali būti uždarytas avies serumu, triušio serumu arba BSA.

Eksperimento sąlygų parinkimas

Atliekant ELISA svarbu pasirinkti įvairias eksperimentines sąlygas, įskaitant: (1) Kietosios fazės nešiklių pasirinkimas: daugelis medžiagų gali būti naudojamos kaip kietosios fazės nešikliai, pvz., PVC, polistirenas, poliakrilamidas ir celiuliozė. Jis gali būti įgaubtos plokštelės, mėgintuvėlio, karoliuko ir kt. pavidalu. Šiuo metu jis dažniausiai naudojamas 40 šulinėlių polistirolo įgaubtoms plokštelėms.

Nesvarbu, koks nešiklis, prieš naudojimą gali būti patikrintas: su tuo pačiu kiekiu antigeno pakuotės tomis pačiomis eksperimentinėmis sąlygomis reikia reaguoti, stebėti, ar jo spalvos perteikimo reakcija yra vienalytė, pagal kurią jis yra geras adsorbcijos efektyvumas. (2) Pakuotė pagal antikūnų (arba antigenų) atranką: antikūnas (arba antigenas) adsorbuotas ant kietos -fazės nešiklio paviršiaus, reikalavimas yra didesnis, adsorbcijai paprastai reikalingas pH nuo 9,0 iki 9,6. Adsorbcijos temperatūra, laikas ir baltymų kiekis taip pat turi tam tikrą įtaką, paprastai daugiau nei 4 °C per 18–24 valandas. Reikia titruoti optimalią baltymų pakelių koncentraciją: supakavus skirtingos koncentracijos baltymus (0,1, 1,0 ir 10 μg/ml ir tt), teigiamų mėginių OD vertės stebimos, kai kitos tyrimo sąlygos yra vienodos. Pasirinkite didžiausią OD vertę ir mažiausią baltymų kiekį turinčią koncentraciją.

Daugumos baltymų jis paprastai yra nuo 1 iki 10 μg/ml. (3) Fermentu -pažymėtų antikūnų darbinės koncentracijos parinkimas: pirma, pradinis titravimo, naudojant tiesioginį ELISA metodą, poveikis (žr. fermentu -pažymėtų antikūnų dalį).

Tada pataisykite kitas sąlygas arba taikykite „kvadratinės masyvo metodą“ (sudėtingas, tiriamo mėginio nuoroda, o fermentu -pažymėti antikūnai yra skirtingi praskiedimai) formalioje eksperimentinėje sistemoje tiksliai titruoja jos darbinę koncentraciją. (4) Fermento bazės ir vandenilio donoro pasirinkimas: vandenilio donoro pasirinkimas yra nebrangus, saugus, su skaidrios spalvos -perteikimo reakcija, o pats yra bespalvis. Kai kurie vandenilio donorai (pvz., OPD ir kt.) gali sukelti kancerogeninį poveikį, todėl reikia pasirūpinti apsauga. Sąlyginiai žmonės turėtų naudoti ne-kancerogeninius, didelio jautrumo vandenilio donorus, tokius kaip TMB ir ABTS šiuo metu yra labiau patenkinami vandenilio donorai. Praėjus tam tikram veikimo laikotarpiui, norint sustabdyti reakciją, reikia pridėti stiprių rūgščių arba šarmų. Paprastai substrato veikimo laikas yra 10-30 minučių. Pagrindo naudojimo skystis turi būti paruoštas šviežiai, ypač jei prieš naudojant įpilama H2O2.